Экспресс-анализ афлатоксинов в кукурузе, злаках и миндале с помощью системы ACQUITY UPLC класса H с флуоресцентным детектированием

09.10.2019

Применение системы ACQUITY UPLC® класса H с высокочувствительной проточной ячейкой большого объема и флуоресцентным детектором ACQUITY® (FLR) позволяет обнаруживать афлатоксины на законодательно установленных уровнях.

Марк Э. Бенвенути и Дженнифер А. Берджесс
Waters Corporation, Милфорд, Массачусетс, США

Преимущества метода

  • Высокая чувствительность для соответствия нормативным требованиям

  • Возможностьтрехкомпонентногосмешиваниядляоптимизациихроматографическогоразделения

  • Не требует проведения дериватизация

  • Повышенная производительность благодаря более высокой скорости анализа

 

Решения WATERS

  • ACQUITY UPLC класса H с флуоресцентным детектированием.
  • Колонки VICAM® AflaTest®

 

Ключевые слова

Афлатоксины, флуоресценция, микотоксины, безопасность пищевых продуктов


Введение

Загрязнение пищевых продуктов микотоксинами является одной из наиболее важных проблем в области безопасности пищевых продуктов и кормов. Микотоксины вырабатываются плесенью, которая может расти в определенных условиях окружающей среды до сбора урожая, во время транспортировки и хранения, а также в процессе обработки. Одним из наиболее распространенных микотоксинов являются афлатоксины, производимые грибами рода Асперги́ллюс. К основным афлатоксинам относятся B1, B2, G1 и G2. М1 и М2 – метаболиты, которые образуются при кормлении молочных животных зерном, загрязненным афлатоксинами В1 и В2. Структуры этих соединений представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 – Химические структуры афлатоксинов..jpg

Рисунок 1 – Химические структуры афлатоксинов.

 

Указанные соединения токсичны и могут быть канцерогенными для людей и животных. Из-за этой токсичности государственные регулирующие органы накладывают строгие ограничения1,2 на их содержание в пищевых продуктах. B1 и G1 являются более сильнодействующими по отношению к B2 и G23 и эта разница отражена в законодательных уровнях. Европейский союз (ЕС) недавно пересмотрел свое законодательство, касающееся разрешенных уровней афлатоксинов и требований к отбору проб для тестирования. Первоначально нормы были установлены в регламенте Комиссии ЕС 1881/20061, а   дополнительные требования – в регламенте Комиссии ЕС 165/20102. Данные требования в отношении микотоксинов являются самыми строгими во всем мире.


Условия эксперимента

Условия ЖХ

Система ЖХ:                 ACQUITYUPLCкласса H

Время анализа:            4.0 минуты

Колонка:                        ACQUITYBEHC18, 1.7 мкм,

2.1 x 100 мм при 30°C

Подвижная фаза A:       вода

Подвижная фаза B:       метанол

Подвижная фаза C:       ацетонитрил

Скорость потока:           0.4 мл/мин

Объём вводимой пробы: 20 мкл (с применением дополнительного контура на 50 мкл)


Время (мин)

Скорость потока (мл/мин)

%A

%B

%C

Начало

0.4

64

18

18

(Изократический режим)

 

Условия флуоресценции

Возбуждение:                365 нм

Эмиссия:                         429 нм (M1, B2, B1)

Эмиссия:                         456 нм (G2, G1)

 

В соответствии с европейским законодательством максимально допустимая концентрация афлатоксина B1 в зерновых составляет 2,0 мкг/кг, а суммарная концентрация B1, B2, G1 и G2 не должна превышать значение 4,0 мкг/кг. Для орехов допустимые концентрации находятся в диапазоне от 2 до 12 мкг/кг для B1 и от 4 и до 15 мкг/кг для суммарной концентрации B1, B2, G1 и G2. В частности, для миндаля предельные уровни составляют 8,0 мкг/кг и 10,0 мкг/кг соответственно. Для М1 в сыром молоке максимально допустимый уровень составляет 0,05 мкг/кг. Для детской смеси и молочной смеси второго уровня установленное предельно допустимое значение M1 равняется 0.025 мкг/кг. Для анализа афлатоксинов разработано много методов, включая тонкослойную хроматографию (ТСХ), иммуноаффинную хроматографию, ВЭЖХ, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и ЖХ/МС/МС. Максимальную селективность и чувствительность для количественного анализа обеспечивает ЖХ/МС/МС, однако данный метод требует значительных инвестиций для лабораторий, которые еще не обладают необходимым набором инструментов или навыков. Для решения этой задачи может применяться альтернативная технология селективного иммуноаффинного разделения с высокочувствительным флуоресцентным детектированием. Однако, поскольку элюенты с обращенной фазой гасят флуоресценцию афлатоксинов B1 и G1, общим условием для усиления реакции этих аналитов является выполнение процедуры дериватизации.4,5

В этой работе при анализе афлатоксинов в миндале, кукурузной муке и упакованной смеси злаков, содержащей сухое молоко, мы использовали набор прикладных программ для анализа афлатоксина WatersACQUITYUPLC и систему ACQUITYUPLC класса H.

Детектор ACQUITY FLR с проточной ячейкой большого объема устраняет необходимость в длительных и трудоемких этапах дериватизации, которые зачастую требуются для обнаружения афлатоксинов на регламентированных уровнях. Благодаря простоте системы ACQUITYUPLC класса H и возможности автоматического смешивания до четырех растворителей достигается простота эксплуатации и гибкость ВЭЖХ с производительностью СВЭЖХ®.

 

Подготовка стандартных образцов

Два маточных стандартных раствора 46319-U и 46304-U были приобретены у компании Supelco; данные растворы использовали для подготовки промежуточных смесей в метаноле, которые разбавлялись 1 % уксусной кислотой (водн.) для получения шести стандартных смесей, концентрация которых представлена в таблице 1. Концентрации этих растворов определяют концентрацию конечного экстракта, который получается при выполнении описанной ниже процедуры подготовки пробы. Каждый стандарт вводился троекратно в объеме 20 мкл.

Подготовка пробы

Отдельные образцы цельных зерен кукурузы, очищенного миндаля и не предназначенных для детского питания злаков с сухим молоком были разделены на две части по 25 г. Одна часть исследовалась без введения каких-либо добавок. Другая часть была помечена стандартами афлатоксина с предельными уровнями концентрациями, установленными в ЕС, которые приведены ниже. Затем обе части прошли процедуру очистки VICAMAflaTest. 


Процедура внесения добавок

В совокупности в каждый образец добавляли 4 мкг/кгафлатоксинаB и G (1,54 мкг/кг B1). Такое значение было получено путем добавления 384,6 мкл раствора в концентрации 0,26 мг/л в смеситель для приготовления образца.

Кроме того, злаки с сухим молоком были помеченыафлатоксином М1 в концентрации 0,05 мкг/кг путем добавления 125,0 мкл раствора М1 с концентрацией 0,01 мг/л.


Процедура подготовки образца AflaTest6

  • С помощью смесителя смешать 25 г образца, 5 г хлорида натрия и 100 мл смеси метанол: вода (класс ВЭЖХ) в соотношении 80:20 на высокой скорости, в течение 1 минуты.

  • Отфильтровать эту смесь через гофрированную фильтровальную бумагу Ватмана (фильтрат 1).

  • Смешать 10 мл фильтрата 1 и 40 мл воды.

  • Отфильтровать раствор через фильтровальную бумагу из стеклянного микроволокна (фильтрат 2).

  • Загрузить 10 мл фильтрата 2 в колонку для аффинной хроматографии VICAM AflaTest, номер по каталогу G1024.

  • Промыть двумя порциями воды по 10 мл со степенью чистоты, подходящей для ВЭЖХ.

  • Выполнить элюирование с применением 1 мл подходящего для ВЭЖХ метанола.

  • Развести 1 % водным раствором уксусной кислоты в соотношении 1:1 и выполнить ввод.

Полученный раствор, при условии 100% извлечения, имел расчетную общую концентрацию афлатоксинов B, G на уровне 1000 нг/л и 12,5 нг/л для M1 (меченые злаки). Всего для проведения СВЭЖХ-анализа с флуоресцентным детектированием было введено 20 мкл пробы.

 

Обсуждение результатов 

Разделение анализируемых в этой работе афлатоксинов достигалось менее чем за 4 минуты. На рисунке 2 показано репрезентативное наложение шести различных концентраций стандартных смесей.


Рисунок 2 – Репрезентативное наложение хроматограмм шести стандартных смесей..jpg

Рисунок 2 – Репрезентативное наложение хроматограмм шести стандартных смесей.


Выходной сигнал от B1 и G1 был меньше, чем от B2 и G2 из-за гасящего влияния растворителей на флуоресценцию этих двух соединений. Однако детектор ACQUITY FLR с проточной ячейкой большого объема уверено обнаруживал B1 и G1 на необходимых уровнях без выполнения дериватизации.

Количественная оценка меченых проб выполнялась посредством расчёта по калибровочной кривой для каждого анализируемого вещества. На рисунке 3 показаны калибровочные кривые для каждого из анализируемых веществ. Коэффициент детерминации (R2) для всех анализируемых веществ превышал значение 0,995.


Рисунок 3 – Калибровочные кривые для анализируемых афлатоксинов. Единицы измерения нг-л..jpg

Рисунок 3 – Калибровочные кривые для анализируемых афлатоксинов. Единицы измерения нг/л.


Указанные в таблице 1 диапазоны концентраций были выбраны для охвата концентраций экстрактов из образцов, которые соответствуют законодательно установленным уровням.


#

M1

G2

G1

B2

B1

1

5.7

3.5

12.9

4.0

12.7

2

11.4

6.9

25.8

8.0

25.3

3

22.8

13.9

51.6

16.1

50.5

4

113.8

69.3

257.8

80.3

252.5

5

227.6

138.6

515.5

160.5

505.0

6

455.3

227.0

1031.0

321.0

1010.0


 

На рисунке 4 показаны хроматограммы кукурузы, миндаля и злаков без добавок и с добавками соответственно. Следы В1 и В2 были обнаружены в матрицах без добавок, наибольшая концентрация В1 в кукурузе была на уровне 0,025 мкг/кг, что значительно ниже предельно допустимой нормы, составляющей 2 мкг/кг. Соответствующие участки хроматограмм представлены в увеличенном масштабе. В дальнейшем, перед расчетом процента извлечения, исходные количества вычитались из извлеченного объема. Процент извлечения каждого из анализируемых веществ показан в таблице 2. Все полученные значения находятся в диапазоне от 84 % до 116 %. Представленная на рисунке 4 хроматограмма для меченых злаков содержит увеличенную область, которая наглядно демонстрирует продетектированный пик афлатоксина M1.


Рисунок 4 - Хроматограммы кукурузы, миндаля и злаков с добавками и без добавок..jpg

Рисунок 4 - Хроматограммы кукурузы, миндаля и злаков с добавками и без добавок.


Таблица 2 – Процент извлечения для меченой кукурузы, миндаля и злаков.

Анализируемое вещество

% Извлечения

Кукуруза

% Извлечения

Миндаль

% Извлечения

Злаки

M1

115.8

G2

109.8

91.3

102.2

G1

108.7

88.6

101.5

B2

110.6

89.4

102.9

B1

104.7

84.6

98.1

 

В таблице 3 перечислены время удерживания и воспроизводимость площади пика для трех вводов каждой из меченых матриц. Воспроизводимость времени удерживания для всех вводов стандартов с растворителем и меченых проб показана в таблице 4. Данные получены по 27 вводам пробы.

Таблица 3 – Относительное среднеквадратическое отклонение времени удерживания и рассчитанное содержание по трем вводам меченых матриц.

Анализируемое вещество

Кукуруза

Миндаль

Злаки

 

Время удерживания

Количество

Время удерживания

Количество

Время удерживания

Количество

M1

0.39

6.04

G2

0.06

0.28

0.16

0.76

0.17

0.03

G1

0.04

1.34

0.16

0.98

0.16

0.62

B2

0.06

0.42

0.13

0.75

0.13

0.08

B1

0.03

0.21

0.08

8.16

0.10

0.65

 

Таблица 4 – Относительное среднеквадратическое отклонение времени удерживания для стандартов и проб (всего 27 вводов).

Анализируемое вещество

Время удерживания

M1

0.40

G2

0.47

G1

0.42

B2

0.36

B1

0.33

 

Заключение

В этой работе система ACQUITY UPLC класса H в сочетании с проточной ячейкой большого объема позволила провести количественный анализ афлатоксинов с флуоресцентным детектированием без выполнения дериватизации. Исключение этапа дериватизации сокращает дополнительный объем после колонки, который может привести к расширению полосы, и тем самым обеспечивает поддержание высокого отношения сигнал/шум. Меньшее количество приборных модулей позволяет упростить обучение, устранение неполадок и уход. Благодаря применению процедуры очистки AflaTest был достигнут высокий уровень извлечения афлатоксинов из трех разных матриц. Для каждого из афлатоксинов в тестируемых матрицах были достигнуты наиболее строгие в мире регламентированные пределы.

Система ACQUITY UPLC класса H сочетании с набором прикладных программ для анализа афлатоксинов является простым в использовании решением для обнаружения афлатоксинов. Возможность автоматического смешивания до четырех растворителей устраняет необходимость предварительного смешивания подвижных фаз и обеспечивает дополнительную гибкость при разработке метода. Время анализа составляет менее 4 минут, что увеличивает пропускную способность по сравнению с методами ВЭЖХ, тем самым повышая производительность лаборатории.


Перечень литературы

  1. Регламент Комиссии ЕС 1881/2006.

  2. Регламент Комиссии ЕС 165/2010.

  3. Грибковые токсины, экономическая устойчивость и техно - коммерческие последствия. Frost and Sullivan, стр. 29, 2001.

  4. Кок В.Т. Реакции дериватизации для определения афлатоксинов методом жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием. Журнал о хроматографии B, 659: 127-137, 1994.

  5. Джошуа и соавт. Одновременное определение шести афлатоксинов, зеараленона и охратоксина-А с использованием ВЭЖХ с градиентным элюированием. Постколоночная фотохимическая дериватизация и флуоресцентное детектирование. Представлено на 110-м Международном совещании и выставке AOAC, 8-12 сентября 1996 г., Орландо, Флорида.

  6. Руководство по эксплуатации VICAM. 715001733 ред. A, 2007.

Вернуться обратно
ОПУБЛИКОВАТЬ В СОЦ.СЕТЯХ