Исследование переноса при использовании различных промывочных растворителей и объемов

12.02.2020
Данное исследование было направлено на изучение зависимости степени переноса от количества последовательных этапов промывки.

Аннотация

Установлено, что на перенос образца оказывают существенное влияние как объем промывки, так и свойства моющих растворов. При применении трех этапов промывки (общий объем 750 мкл) перенос пробы был снижен до менее 0,003% для обоих аналитов, кофеина и хлоргексидина. В случае использования функции расширенной промывки перенос образца может быть дополнительно снижен в 10 раз. При этом расширенная промывка подразумевает применение двух различных промывочных растворов. Первым обычно является сильный органический растворитель, который должен удалить все оставшиеся остатки образца. Второй промывочный раствор впоследствии используется для полного вымывания органического моющего раствора из жидкостной системы. Для этой задачи подходит элюент с самой низкой силой элюирования. На примере применения функции расширенной промывки удалось достичь переноса на уровне около 0,0003%. Такое низкое значение переноса делает данную процедуру промывки особенно выгодной для применения при анализе следовых количеств с использованием высокочувствительных МС/МС или электрохимических детекторов.

Введение

Перенос – это появление небольшого пика анализируемого образца при введении пустой пробы после образца [1]. Это явление связано с наличием остатков ранее вводимого в систему образца. Одним из факторов, существенно влияющих на перенос, является используемый режим ввода пробы. В режиме отбора малого объема пробы на уровне микролитров всасывается только заданное количество образца. Режим полного заполнения контура, подразумевает захват объема пробы, соответствующего не только объему контура, но и дополнительного объема, в три раза, превышающего объём пробоотборной петли. Это переполнение выполняется для того, чтобы петля была полностью заполнена образцом, что гарантирует максимальную воспроизводимость. Кроме того, на перенос также влияет сам образец, поскольку его адгезионные свойства определяют, насколько сильно он прилипает к поверхности. Для предотвращения переноса между двумя циклами анализа, необходимо выполнять процедуру тщательной промывки с целью удаления остатков образца в системе ввода пробы. Минимизация переноса необходима особенно при работе с очень чувствительными методами обнаружения, чтобы избежать ложноположительных результатов. В данном исследовании было определено значение переноса автоматического пробоотборника KNAUER AZURA AS 6.1L и разработана оптимизированная процедура промывки.

Результаты

Одной из двух основных причин переноса является наличие небольших полостей в системе. С каждым вводом пробы перенос снижается вследствие разбавления небольшого количества образца из этих полостей. Данный перенос можно легко определить, используя кофеин в качестве аналита. В процессе исследований был проанализирован перенос системы ВЭЖХ AZURA для разных режимов ввода пробы и трех различных этапов промывки, результаты представлены в таблице 1.


Таблица 1 – Перенос кофеина для различных режимов ввода пробы с 1, 2 и 3 этапами промывки (250 мкл каждый)

Перенос, %

Ввод малого объема пробы

Частичное заполнение петли

Полное заполнение петли

1 этап промывки

0.0000

0.0196

0.0000

2 этапа промывки

0.0000

0.0029

0.0000

3 этапа промывки

0.0000

0.0024

0.0000


Результаты показывают, что перенос в режиме полного заполнения петли и в режиме ввода малого объема пробы на уровне микролитров не обнаруживается даже при использовании одного этапа промывки. В режиме частичного заполнения наблюдается перенос, который может быть снижен до 0,005% посредством двухэтапной промывки. Второй основной причиной переноса является химическая адсорбция образца на смачиваемой поверхности петли, иглы, трубок и клапанов системы ввода пробы. Такой перенос можно определить с помощью липкого вещества, такого как хлоргексидин. Определение переноса хлоргексидина было совмещено с разработкой оптимизированной процедуры промывки для пробоотборной системы AS 6.1L (результаты представлены в таблице 2).


Таблица 2 – Перенос хлоргексидина для различных режимов ввода пробы с 1, 2 и 3 этапами промывки (250 мкл каждый)

Перенос, %

Ввод малого объема пробы

Частичное заполнение петли

Полное заполнение петли

1 этап промывки

0.0648

0.0171

0.0019

2 этапа промывки

0.0041

0.0020

0.0006

3 этапа промывки

0.0017

0.0019

0.0006

Во всех трех режимах ввода пробы два этапа промывки приводят к переносу менее 0,005%. Поскольку наибольшее значение переноса наблюдалось при вводе малого объема пробы, оптимизация процедуры промывки выполнялась именно в этом режиме. Для этой процедуры применяли два различных промывочных раствора. Первый этап промывки изопропанолом должен удалить хлоргексидин, в то время как последующий этап с подвижной фазой предназначен для повторного удаления изопропанола. Объемы постепенно увеличивали с шагом 250 мкл, начиная с комбинации из 750 мкл изопропанола и 750 мкл элюента, до 1500 мкл. Полученное значение переноса представлено в таблице 3.


Таблица 3 – Перенос хлоргексидина при различных объемах изопропанола, используемого на первом этапе промывки, и элюента, используемого на втором этапе промывки

Объем изопропанола на первом этапе промывки, мкл

Объем элюента на втором этапе промывки, мкл

Перенос, %

750

750

0.0028

1000

1000

0.0031

1250

1250

0.0022

1500

1500

0.0003

1500

750

0.0016


Можно отметить, что существенной разницы между сочетанием 2 x 750 мкл и 2 x 1000 мкл не наблюдается. Перенос значительно снижается, начиная со значения 1250 мкл, а при объеме промывочного раствора 1500 мкл практически не определяется. При использовании сочетания  1500 мкл изопропанола и 1500 мкл подвижной смеси был получен перенос около 0,0003%.

На рисунке 1 показаны результаты ввода пустой пробы до и после ввода стандарта хлоргексидина в концентрации 2000 мкг/ мл в сравнении с концентрацией 10 мкг/мл. Необходимость коррекции объема жидкого промывочного изопропанола в зависимости от аналита должна рассматриваться в каждом отдельном случае.


Результаты ввода стандарта хлоргексидина

Рисунок 1 – Результаты ввода стандарта хлоргексидина 10 мкг/мл (красная кривая), пустой пробы 1 (синяя кривая) до и пустой пробы 2 (зеленая кривая) после ввода стандарта хлоргексидина 2000 мкг/мл между этапами промывки с 1500 мкл изопропанола и 1500 мкл элюента (режим ввода малого объема пробы на уровне микролитров).


Заключение

Перенос AZURA AS 6.1L, вызванный наличием небольших полостей в системе, может быть снижен до 0,003% за счет применения двух этапов промывки. Применение оптимизированной процедуры промывки может быть целесообразным для конфигураций системы с чувствительными детекторами либо при работе с липкими веществами. Процедура промывки, в которой применяется 1500 мкл изопропанола и 1500 мкл подвижной фазы, снижает перенос до 0,0003% в режиме частичного заполнения петли. В режиме полного заполнения контура и отбора малого объема пробы значение переноса снижается еще больше. Поскольку значение переноса образца зависит как от вещества, так и от метода анализа, исследования переноса образца должны выполняться при разработке любого метода. Это исследование должно выполняться не только в отношении хроматографического метода, но и пробоподготовки.

Перечень литературы

[1] Зенг В., Муссон Д.Г., Фишер А.Л. и Ванг А.К. (2006), Новый подход к оценке переноса и его влияния на количественное определение в высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемном масс-спектрометрическом анализе. Rapid Commun. Mass Spec., 20: 635-640.


Авторы: Свеа Стефан, Тиль Майрах, Карстен Лош, Кейт Монкс - KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH.

Вернуться обратно
ОПУБЛИКОВАТЬ В СОЦ.СЕТЯХ