Применение десорбционной ионизации для визуализации тканей молочной железы

15.10.2019
Визуализация с применением метода DESI обеспечивает эффективную пространственную локализацию биомолекул в срезах тканей молочной железы с минимальной подготовкой образца

Цель

Применение метода десорбционной ионизации под действием электрораспыления (DESI) в сочетании с масс-спектрометрической визуализацией (MSI) средствами квадрупольного времяпролётного (QTof) масс-спектрометра Xevo® G2-XS для дифференциации типов тканей в образцах молочной железы при клинических исследованиях.

56652.jpg


Исходные данные

В последнее десятилетие исследователи все чаще используют масс-спектрометрическую визуализацию для исследования распределения метаболитов, лекарств, пептидов и белков на поверхности тканей. Возможность применения MSI для однозначного отображения сотен биомолекул в одном анализе привела к тому, что данный подход широко используется в процессе научных исследований рака.

Также в последнее время все чаще применяется метод десорбционной электрораспылительной ионизации (DESI), поскольку такая мягкая ионизация может выполняться в условиях окружающей среды. Кроме того, он практически не требует подготовки образца и является минимально инвазивным, что делает его пригодным для прямого анализа тканей. DESI-MSI позволяет получить объективную информацию о биохимическом распределении молекул с помощью всего одного измерения.

p_1.jpg

Рисунок 1 – Процесс исследования тканей молочной железы с применением DESI-MSI.


Таким образом, этот метод обеспечивает надежное распознавание ткани и идентификацию ионных картин тканеспецичных липидов, что в будущем может быть полезным при диагностике и прогнозировании рака на гистологическом уровне. Метод DESI-MSI совместим с масс-спектрометрами Waters® SYNAPT® G2-Si и Xevo G2-XS.

Решение

Для исследования ткани молочной железы методом DESI-MSI, на предметное стекло помещали свежезамороженный срез ткани толщиной 10 мкм (рис. 1А). Срез размещался непосредственно на подвижном предметном столике источника DESI Prosolia 2D без какой-либо дополнительной предварительной подготовки. После чего выполняли запись оптического изображения и его регистрацию в программном обеспечении High Definition Imaging (HDI®), версия 1.4 (Рисунок 1D). Полученное оптическое изображение затем использовали для определения отображаемой области.

Типичный эксперимент с применением DESI-MSI включает построчное разделение срезов тканей на пиксели ионизирующим пучком, с целью регистрации масс-спектров в определенных координатах x и y. Каждая точка выборки соответствует уникальному масс-спектру. Исследования образцов молочной железы методом DESI-MSI выполнялись с применением смеси растворителей 95:5 метанол:вода, размер пикселя по оси х составлял 100 мкм, частота сбора данных – пять сканирований в секунду.

После выполнения анализа методом DESI-MSI проводили окрашивание срезов тканей гематоксилином и эозином (H&E) (рис. 1С), что возможно поскольку DESI является неразрушающим методом.  Наложение оптического изображения после окрашивания H&E на ионные изображения, полученные с помощью DESI-MS, позволяет выполнить топографическое сравнение биохимических характеристик одного и того же участка. При анализе ткани молочной железы, метод DESI показал очень хорошую дифференциацию злокачественного компонента от остальной части ткани, как показано на рисунке 2, где PI(38:3), соответствующий m/z 887.56, характерен для злокачественной части ткани. Статистический анализ выполнялся с применением обработанных в программном обеспечении HDI данных DESI-MSI, путем предварительного определения исследуемых областей (ИО) на ионных изображениях, полученных посредством масс-спектроскопической визуализации на основании гистопатологических аннотаций. Проводилась оценка различий между двумя найденными типами тканей (строма и опухоль).

p_2.jpg

Рисунок 2 – Ионные изображения для образца молочной железы с инфильтративно-протоковой карциномой (IDC) 2-й степени, полученные с помощью анализа методом DESI-MSI в режиме отрицательных ионов a) m/z 887.56, b) m/z 750,54. c) окрашенный H&E срез ткани молочной железы d) комбинированные спектры в режиме отрицательных ионов, с выделенными значениями m/z для жирных кислот и фосфолипидов.



На рисунке 3 показаны результаты анализа основных компонентов (PCA) с использованием программного обеспечения SIMCA (Umetrics), которые указывают на хорошее соответствие сгенерированной модели с высокими коэффициентами R2 (соответствие регрессионной модели) и Q2 (прогностическая способность модели). Рабочие процессы SIMCA позволяют связать ионные изображения из набора данных с графиком в HDI. Также может применяться ряд других коммерческих статистических программных пакетов, а также инструментов собственной разработки.

Другим исследуемым вариантом был импорт необработанных данных визуализации в среду MATLAB для дальнейшего анализа. Для визуальной дифференциации различных областей образца среза с инфильтративно-протоковой карциномой (IDC) 2-й степени выполняли неконтролируемый анализ основных компонентов. Для контролируемой классификации применялся рекурсивный анализ по критерию максимально допустимого отклонения (RMMC).

p_3.jpg

Рисунок 3 – Дифференциация типа ткани с использованием программного обеспечения для статистического анализа SIMCA. Области интереса на строме и опухоли разделяются посредством анализа основных компонентов (PCA). Диаграмма критерия соответствия указывает на хорошее соответствие регрессионной и прогнозной моделей.



Определение типов тканей в каждом образце и их пространственное распределение выполнялось независимым гистопатологом на основе оптического изображения образца окрашенного H&E (Рисунок 4).

p_4.jpg

Рисунок 4 – Три основных компонента MMC, соответствующие трем основным типам тканей (злокачественная, жировая и строма), обнаруженные в образце молочной железы с инфильтративно-протоковой карциномой (IDC) 2-й степени, а также изображение ткани, окрашенной H&E, ионное изображение и RGB изображения трех компонентов, полученные в режиме отрицательных ионов.


С учетом полученной информации из ионного изображения выбирали небольшое количество репрезентативных для ткани масс-спектров, которые применялись для построения характерной для образца модели RMMC. В дальнейшем данную модель использовали для классификации всех пикселей в различных типах тканей. Собранные данные применялись для перекрестной проверки, при которой была получена 100 % точность в режиме отрицательных ионов (рисунок 5).

p_5.jpg

Рисунок 5 – а) PCA (анализ основных компонентов), b) контролируемый анализ с RMMC и c) точность перекрёстной проверки с исключением для данных, полученных в режиме отрицательных ионов для разных типов тканей одного образца молочной железы.



Выводы

Визуализацию с помощью десорбционной ионизации под действием электрораспыления в масс-спектрометрии можно рассматривать как эффективное средство оценки пространственной локализации и распределения молекул в образцах тканей молочной железы в условиях окружающей среды при клинических исследованиях.

К преимуществам DESI-MSI при анализе образцов тканей молочной железы можно отнести:
 
  • Минимальные требования к подготовке образцов для построения изображения 
  • Минимальное разрушение образца, что позволяет проводить последующие анализы на одном и том же срезе ткани (например, окрашивание H&E)
  • Возможность дифференциации основных типов тканей молочной железы с высокой точностью с применением различных статистических инструментов, таких как HDI/Umetrics или собственных программных пакетов, разработанных с помощью MATLAB.

Только для исследовательских целей. Не для использования в диагностических процедурах.
Вернуться обратно
ОПУБЛИКОВАТЬ В СОЦ.СЕТЯХ