Применение масс-спектрометрии с мониторингом множественных реакций для анализа более 1000 пестицидов

07.03.2019
Уровень опасности пестицида зависит от двух факторов: токсичности пестицида и воздействия этого пестицида на человека
В поисках более быстрых, безопасных и рациональных методов производства продуктов питания, многие производители сельскохозяйственной продукции применяют пестициды для защиты посевов от вредных организмов и культур, таких как сорняки (гербициды), насекомые (инсектициды) и грибы (фунгициды). Такие химические и биологические агенты улучшают культивирование, но связаны с издержками. Остатки токсичных пестицидов могут оставаться в сельскохозяйственных продуктах даже после уборки урожая.


Ограничение воздействия токсичных пестицидов

Уровень опасности пестицида зависит от двух факторов: токсичности пестицида и воздействия этого пестицида на человека. Длительное хроническое воздействие может привести к более серьезным заболеваниям и расстройствам, включая поражение крови и нервов и даже вызвать рак. Из-за этих рисков Агентство по охране окружающей среды США устанавливает допустимые уровни в отношении максимального количества пестицидов в или на продуктах питания в Соединенных Штатах. В других странах применяется термин «максимально допустимый уровень» либо «максимальное остаточное содержание» (MRL). Примеры допусков на пестициды в различных товарах в соответствии с требованиями EPA приведены в таблице 1.


Таблица 1 – Допуски на пестициды, установленные EPA

Пестицид

Продукт

Частей на миллион

Капатан

Яблоко

25.0

Капатан

Зерно, злаки

0.05

Капатан

Персик

15.0

 

Дикамба

Ячмень, зерно

6.0

Дикамба

Кукуруза, зерно

0.1

Дикамба

Пшеничное зерно

2.0

 

Имидаклоприд

Банан

0.5

Имидаклоприд

Черника

3.5

Имидаклоприд

Рыба

0.05

 

Азоксистробин

Спаржа

0.04

Азоксистробин

Арахис

0.2

Азоксистробин

Перечная мята

30.0

 

Глифосат

Свекла, сахар, ботва

10.0

Глифосат

Яйцо

0.05

Глифосат

Домашняя птица, мясо

0.1


Анализ остаточных пестицидов.

Анализ пестицидов является сложной задачей. В Соединенных Штатах ежегодно используется более 1 миллиарда фунтов пестицидов различных типов, которые подлежат анализу. Пестициды представляют собой сложные вещества, а многочисленные остаточные пестициды принадлежат к различным классам и для их анализа может потребоваться тандемный масс-спектрометр с жидкостным хроматографом (ЖК-МС/МС), либо тандемный масс-спектрометр с газовым хроматографом (ГХ-МС/МС). Эти приборы называются тройными квадрупольными масс-спектрометрами. Тип используемого прибора будет зависеть от характеристик пестицида, таких как полярность, летучесть, термическая стабильность и эффективность ионизации.


ЖХ-МС/МС и мониторинг множественных реакций

Применение технологии ЖХ-МС/МС для анализа безопасности сельскохозяйственных культур и определения соответствия концентрации пестицидов допустимым уровням, установленным EPA, зачастую является сложным и длительным процессом. Исследования показали, что можно провести быстрый количественный анализ 646 пестицидов с 1929 переходами в режиме мониторинга множественных реакций всего за 10,5 минут. При использовании тройного квадрупольного масс-спектрометра Shimadzu LCMS-8060 с ионоводом (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD) данные получали со скоростью до 30000 мкм/с с шагом 0,1 дальтон без потери точности по массе. LCMS-8060 обеспечил анализ 612 пестицидов в режиме положительных ионов и 34 соединений в режиме отрицательных ионов при времени переключения полярности 5 мсек.

Пищевые экстракты мяты, томатов и яблок поставлялись Phytocontrol (Ним, Франция) в соответствии с установленными протоколами QuEChERS. Конечные экстракты подготавливали в ацетонитриле без разбавления. В качестве стандартных растворов применялись сертифицированные эталонные материалы для библиотеки MRM Shimadzu Pesticide, полученные от ACSD (Траппес, Франция). Качество всех растворителей, приобретенных у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) соответствовало требованиям ЖХ/МС.

Для получения шеститочечной калибровочной кривой в диапазоне от 0.002 до 0.1 мг/кг (2-100 пг/мкл) использовали метод внутреннего стандарта. Для количественной оценки при последовательном вводе проб с помощью автосамплера добавляли два внутренних стандарта (Атразин-d5 и Диурон-d6). Хроматограмма 646 пестицидов1, добавленных в экстракт мяты в концентрации 0,010 мг/кг, до 3 MRM на соединение с временем переключения полярности, равным 5 мс, показана на рисунке 1.

52165+61+6.jpg

Для данного метода были выбраны 1919 переходов в режиме положительной и отрицательной ионизации с времени переключения 5 мсек (1819 MRM-переходов в режиме положительной ионизации и 100 MRM-переходов при отрицательной).

Рисунок 1 – Хроматограмма 646 пестицидов


Хроматограммы MRM для пестицидов, наиболее часто обнаруживаемых в растительных продуктах, перечисленных в Европейском журнале по безопасности пищевых продуктов 2015 года2, показаны на рисунке 2.

62+62+6.jpg

Рисунок 2 –Хроматограммы MRM для растительных пестицидов


Максимальное остаточное содержание было превышено для 58 пестицидов. Такие соединения, как боскалид, хлорпирифос, ципродинил, фенгексамид, флудиоксонил, пираклостробин и тебуконазол (выделены на MRM-хроматограмме), являются одними из наиболее часто обнаруживаемых соединений, присутствующих в более чем 4% проанализированных образцов. Хроматограммы MRM показывают отклик на каждый пестицид, добавленный в пищевую матрицу при MRL, равном 0,01 мг/кг. Между 6,45 и 6,60 минутами контролировали 25 соединений с коэффициентом вариации площади пика не более 6 % (относительное стандартное отклонение = 6 %) (Рисунок 3).


21652+2+6.jpg

Рисунок 3 – Во временном промежутке от 6,45 до 6,60 минут было обнаружено 25 соединений. Среднее относительное стандартное отклонение не превысило 3% (RSD от 1,1 до 5,9 %)


Площади пика отслеживали для трех пестицидов, добавленных в экстракты матрицы яблока, мяты и томата, в концентрации 0,05 мг/кг в течение 72 часов. Соединения были отобраны таким образом, чтобы отражать отклик в виде площади пика на протяжении всего хроматографического опыта (Рисунок 4).

26+62+62.jpg


Рисунок 4 – Площадь пика для трех пестицидов


На рисунке показаны площади пика пробеназола (RT 5,995 мин) и дипропетрина (RT 6,999 мин) для 1 и 100 ввода пробы, добавленных в экстракты матрицы яблока, мяты и томата. Экстракты помечали в концентрации 0,05 мг/кг и анализировали на протяжении 72 часов.


2+626+.jpg

Рисунок 5 – Площадь пика для пробеназола и дипропетрина

    

Полученные результаты показывают, что при малом времени переключения полярности, равном 5 мсек, множественно-группой метод анализа пестицидов посредством ЖХ-МС/МС обеспечил анализ 34 пестицидов в режиме отрицательных ионов и 612 соединений в режиме положительных ионов. Это создает новые возможности для разбавления образца с целью снижения подавления ионного сигнала и влияния матрицы. Для большинства соединений коэффициент разбавления 1:20 или 1:50 был достаточным для обеспечения извлечения в диапазоне 70–120%. 


ГХ-МС/МС для одновременного анализа остаточных пестицидов 

Системы ГХ-МС/МС позволяют измерять более 400 остаточных пестицидов в пищевых продуктах. Однако одновременный анализ более 400 пестицидов требует низкого времени задержки (времени загрузки данных) в процессе MRM-измерений, что приводит к проблемам с недостаточной чувствительностью и усложняет процесс создания программ MRM-измерений. Следовательно, для выявления пестицидов используется несколько различных методов, при этом для анализа всех компонентов один и тот же образец измеряется несколько раз. Такой подход может значительно снизить производительность из-за времени, необходимого для анализа всех компонентов, задействованных в проверке большого количества пестицидов. 

Группа исследователей изучила возможные варианты решения этих проблем и создала метод одновременного анализа 477 компонентов с оценкой результирующей чувствительности и точности. Матричные растворы готовили путем обработки образцов сои, апельсина, коричневого риса и шпината в соответствии с процедурой предварительной обработки для анализа остаточных пестицидов, а затем очищали их с помощью системы очистки Shimadzu GPC. Затем готовили образцы растворов для измерений (концентрация образца 1 г/мл), при этом в готовые матричные растворы добавляли 477 компонентов (включая вещества внутреннего стандарта) до концентрации 5 ppb (или 200 ppb для веществ внутреннего стандарта). В качестве внутренних стандартных веществ использовали девятнадцать типов суррогатных пестицидов. 

Измерения образцов выполняли на Shimadzu GCMS-TQ8040 в сочетании с МС-системой Twin Line, для каждого компонента определяли два перехода, первый для количественной оценки, второй для подтверждения. Программа измерений создавалась автоматически с помощью технологии Smart MRM.

15665202+6.jpg

Рисунок 6 – Соотношение между временем задержки и временем удерживания


Взаимосвязь между временем задержки и временем удерживания в программе измерений, созданной с помощью Smart MRM, показана на рисунке 6. Среднее время задержки для всех компонентов составляло 12,3 мсек, причем более 6,5 мсек обеспечивалось даже для диапазонов времени удерживания с элюированием большого количества пестицидов. Следовательно, по сравнению с традиционными методами измерений, которые требуют разделения анализа на части, технология Smart MRM обеспечила увеличение времени задержки в среднем в 2,5 раза и существенно упростила создание оптимальных программ MRM-измерений.


561651+61.jpg


Оценку чувствительности программы измерений, созданной с помощью Smart MRM, осуществляли по полученной воспроизводимости результата анализа для каждой матрицы. Распределение относительного стандартного отклонения (RSD)  для каждой матрицы показано на рисунке 7. Результаты показывают, что относительное стандартное отклонение (n = 5) не превышало 10% для 88% целевых компонентов (1618 из 1832 компонентов в четырех типах матриц), что указывает на достижение высокой аналитической точности при одновременном анализе до 477 компонентов. Устранение необходимости разделения анализа на несколько этапов с использованием различных методов, позволило сократить количество вводов пробы и значительно повысить производительность. Это также позволяет снизить частоту обслуживания и затраты. Система Twin Line MS с двумя колонками с различными параметрами разделения обеспечила высокоточное обнаружение несмотря на матричные помехи, которые были выявлены для нескольких компонентов.


Заключение

Точное обнаружение пестицидов имеет решающее значение в обеспечении безопасности потребителей и жизнеспособности производителей продуктов питания. Благодаря передовым технологиям и сверхскоростным методам сканирования ЖХ-МС/МС и ГХ-МС/МС могут обеспечить высокую чувствительность, необходимую для получения информации о качестве сложных образцов.

Вернуться обратно
ОПУБЛИКОВАТЬ В СОЦ.СЕТЯХ