Улучшенное определение пептидов с использованием капиллярной СВЭЖХ и масс-спектрометрии с орбитальной ионной ловушкой

В данной статье продемонстрированы результаты применения улучшенной методики протеомного анализа клеточного лизата HeLa с использованием капиллярной колонки длиной 75 см, а также приведен сравнительный анализ результатов, с результатами, полученными при использовании колонки длинной 50 см.
Применение хроматографического разделения и тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) обеспечивают поддержку «восходящего» протеомного анализа, который стал возможен благодаря развитию технологий приборостроения и как следствие значительному повышению производительности за последние годы. Высокие противодавления, свойственные новейшим системам сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ), позволяют использовать более длинные и эффективные капиллярные колонки. Сочетание такой системы СВЭЖХ и масс-спектрометра высокого разрешения с технологией орбитальной ионной ловушки позволяет достичь превосходных уровней идентификации пептидов, количественного определения белков, а также высокой скорости анализа. В данной статье продемонстрированы результаты применения улучшенной методики протеомного анализа клеточного лизата HeLa с использованием капиллярной колонки длиной 75 см, а также приведен сравнительный анализ результатов, с результатами, полученными при использовании колонки длинной 50 см. Увеличение длины колонки привело к разделению и обнаружению более уникальных пептидов, улучшенному количественному определению белков, а также повышению воспроизводимости и пропускной способности, что подтвердило пригодность описанного метода ЖХ-МС/МС для количественного определения сложных лизатов.


Введение

В отличие от «нисходящих» подходов протеомного анализа которые основаны на прямой фрагментации и анализе нативных белков с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС), традиционные «восходящие» протеомические методы включают три основных этапа: гидролиз белка, хроматографическое разделение и идентификацию с применением МС/МС. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в технологиях и методологии за последние два десятилетия, «восходящий» подход протеомного анализа по-прежнему сопровождается рядом ключевых проблем.

Первая проблема связана с глубиной протеомической идентификации, когда с использованием методов жидкостной хроматографии (ЖХ)-МС/МС улавливается только небольшая часть от общей совокупности пептидов. Вторая проблема связана с чувствительностью и динамическим диапазоном этих подходов при исследовании образцов ограниченного размера, таких как пробы для биопсии, и необходимость точного количественного определения пептидов в широких пределах концентраций, охватывающих несколько порядков. Наконец, многие исследования предполагают протеомический анализ большого количества образцов при различных условиях для получения выборки репрезентативных результатов, поэтому критически важно обеспечить высокую скорость анализа.

Последние достижения в области приборостроения обеспечили значительный прогресс в решении этих задач. Масс-спектрометры с орбитальной ионной ловушкой общепризнаны золотым стандартом для протеомики на основе масс-спектрометрии, с лучшей в своем классе чувствительностью, массовым разрешением и скоростью сканирования. Однако для достижения оптимальной эффективности идентификации и количественного определения белков данная мощная технология обнаружения должна применяться в сочетании с эффективными методами разделения. Наиболее эффективной оказалась обращенно-фазовая нанохроматография с использованием капиллярных колонок из плавленого кварца диаметром 50 – 75 мкм и размером частиц кремнезема от 2 до 3 мкм. Как правило, при выполнении восходящего протеомного анализа применяется капиллярная колонка с внутренним диаметром 75 мкм, которая работает со скоростью потока до 400 нЛ/мин, при этом длина капилляров составляет от 15 до 25 см с градиентами от 15 до 60 минут.

рис 1.png

Рисунок 1 – Типичные хроматограммы для различных градиентов и длин колонок


За последние годы был достигнут значительный прогресс в повышении эффективности разделения пептидов. Производительность разделения может быть количественно определена по значению пиковой емкости (Cp), которая определяется как максимальное количество компонентов, которые могут быть разделены за определенный промежуток времени.

Мехтлер и его коллеги показали, что максимальная пиковая емкость наполненных колонок для жидкостной хроматографиии с обращенной фазой, которая может быть получена для заданного градиента, пропорциональна квадратному корню длины либо размеру частиц, если длина колонки остается постоянной. Другими словами, для достижения лучшего разделения пептидов в течение заданного времени разделения необходимо применять более длинные капилляры либо использовать частицы меньшего размера.

Современные системы сверхэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ) обеспечивают противодавление до 1200 бар, что позволяет использовать более длинные и эффективные колонки. В данной статье продемонстрированы результаты применения улучшенного метода протеомного анализа клеточного лизата HeLa с использованием капиллярной колонки длиной 75 см и хроматографическим градиентом в течение 2 и 4 часов, также приведен сравнительный анализ результатов с результатами, полученными при применении колонки длиной 50 см, которая до недавнего времени была самой длинной высокоэффективной наноколонкой для ЖХ доступной на рынке.


Таблица 1 – Условия градиента

Состав

Градиент 120 минут

Градиент 240 минут

5-28 %B

0-105 минут

0-210 минут

28-40 %B

105-120 минут

210-240 минут

40-95 %B

120-130 минут

240-250 минут

95-95 %B

130-140 минут

250-260 минут

рис 2.png

Рисунок 2 – (B) Полученная ионная хроматограмма для одного из пептидов и усредненные хроматографические показатели для всех 15 контролируемых пептидов каждой экспериментальной конфигурации; (C) Сравнение пиковой емкости для каждой экспериментальной конфигурации.


 

рис3.png

Рисунок 3 – (А) Диаграммы Венна, отражающие наложение технических реплик для идентифицированных белков в каждой экспериментальной конфигурации; (B) Количество идентифицированных пептидных и белковых групп.


Эксперимент

Материалы: Растворители были приобретены у компании Fisher Chemical, а степень их чистоты соответствовала требованиям ЖХ-МС.
Белковые лизаты и калибровочные стандарты были приобретены у компании Thermo Fisher.
Для исследования были подготовлены аликвоты, содержащие 500 нг/мкл белкового лизата клеток HeLa торговой марки Pierce (Thermo Fisher) (номер по каталогу: 88328) и 50 фмоль/мкл стандарта для калибровки времени удерживания пептида торговой марки Pierce (номер по каталогу: 88321) в воде с 0,1% муравьиной кислотой. 2 либо 4 мкл (эквивалент 1 или 2 мкг) клеточного лизата из HeLa вводили непосредственно в колонку.

Хроматография: Анализ проводили с использованием системы СВЭЖХ EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher). Для сравнительного исследования использовались колонки Acclaim PepMap C18 EASY-Spray (размер частиц 2 мкм, внутренний диаметр 75 мкм) (Thermo Fisher) длиной 50 см и 75 см. Подключение колонок к системе ЖХ выполнялось с применением фитингов Dionex nanoViper с ручной фиксацией (Thermo Fisher). Растворитель А представляет собой воду, содержащую 0,1% муравьиной кислоты, а растворитель В раствор ацетонитрила-воды в соотношении 80:20, также содержащий 0,1% муравьиной кислоты. Сводная информация об используемых градиентах приведена в таблице 1. При проведении всех экспериментов поддерживалась постоянная температура колонки 55°С. Вводимый объем, загрузка проб, уравновешивание колонок и условия промывки автопробоотборника были согласованы с продолжительностями градиента и длинами колонок. Скорость потока для обеих колонок составляла 300 нл/мин, что приводило к противодавлению около 900 бар для колонки длиной 75 см и около 600 бар для колонки длиной 50 см.

Масс-спектрометрия: Для пептидного анализа с применением МС/МС использовали масс-спектрометр с орбитальной ионной ловушкой Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Fisher). Сканирования пептидных веществ-предшественников проводились от 375 до 1575 m/z при разрешении с полной шириной на половине максимума 120К (при 200 m/z) с целевым значением количества ионов 4×105 и максимальным временем ввода пробы 50 мс. Длительность рабочих циклов прибора для исследования и МС/МС сканирования составляла 3 секунды (режим максимальной скорости). После выполнения обзорного сканирования выполняли анализ наиболее распространённых веществ-предшественников посредством тандемной масс-спектроскопии с зарядовым состоянием от 2 до 7 и интенсивностью более 5×103.

Прекурсоры были выделены в квадруполе при 1,2 Th. Фрагментация посредством индуцированной столкновениями диссоциации применялась при 35 % энергии столкновения, полученные фрагменты детектировались посредством высокоскоростного сканирования в ионной ловушке. Значение параметра АРУ для МС/МС было равно 104, а максимальное время ввода пробы ограничено временем 35 мс. Время динамического исключения составляло 12 секунд с допуском по массе 10 ppm для ионов предшественников и их изотопов, и активной функции выбора моноизотопных предшественников.

Анализ данных: Исходные данные обрабатывались с помощью программного обеспечения Proteome Discoverer (Thermo Fisher). Поиск спектров МС2 выполнялся с помощью SEQUEST HT по базе данных из 42 085 человеческих белков, включая протеоформы (Uniprot).

Моделируемые пептидные последовательности генерировались посредством триптического гидролиза, с допуском до двух пропущенных разрывов; в качестве фиксированной модификации было выбрано карбамидометилирование (+57.021 Да) остатков цистеина. Окисление метиониновых остатков (+15,9949 Да), ацетилирование белкового N-конца (+42,0106 Да) и дезамидирование аспарагина и глутамина (+0,984 Да) рассматривались как переменные модификации. Допуск к массе предшественников составлял 10 ppm, поиск дочерних ионов выполнялся с допуском 0,8 Да. Спектральные совпадения пептидов были проверены с использованием алгоритма Percolator, основанного на значениях q-критерия с уровнем ложноположительных результатов составляющим 1% (FDR). Используя Proteome Discoverer, пептидные идентификации были сгруппированы в белки и отфильтрованы в соответствии с уровнем ложноположительных результатов составляющим 1%.

Область ионов-предшественников из идентифицированных пептидов была извлечена с помощью плагина детектора области ионов предшественников (Precursor Ions Area Detector).

Для дальнейшего анализа спектральные соответствия и группы пептидов, соответствующие уровню ложноположительных результатов (FDR), были экспортированы и обработаны с использованием DAnTE RDN. Для извлечения ионных хроматограмм стандартов калибровки времени удерживания Pierce и расчета значений полной ширины на половине максимума (FWHM), коэффициентов вариации, изменения времени удерживания и пиковой ёмкости пептидов применяли программное обеспечение Skyline.

 

рис-4.png

Рисунок 4 – (A) Линейный график идентифицированных пептидов в зависимости от времени удерживания; (B) ранжирование белков по их нормированной интенсивности для обеих колонок; (C) преобладающие пути для колонки длиной 75 см и массива данных четырехчасового градиента.




Результаты и обсуждение

Для разделения лизата клеток HeLa использовалась система СВЭЖХ EASY-nLC 1200 и масс-спектрометр с орбитальной ионной ловушкой Orbitrap Fusion Lumos, применялись капиллярные колонки длиной 50 см и 75 см с внутренним диаметром 75 мкм и временем градиента 2 и 4 часа. Типичные хроматограммы для каждой исследованной колонки и градиента показаны на рисунке 1.

Высокая аналитическая воспроизводимость и пропускная способность

Чтобы получить достоверное сравнение между образцами, измеренными в разное время и в разных условиях, и в конечном итоге получить количественную информацию о протеоме, важно достичь воспроизводимости хроматографического разделения.
При проведении эксперимента с различными настройками профили пиков между повторениями были почти идентичны, сдвиги времени удерживания пептида составили менее 1 минуты даже при использовании 240-минутного градиента.

Также было установлено, что хроматограммы основных пиков соответствуют четырем экспериментальным условиям. Между двумя колонками наблюдалось очень мало различий, чего и следовало ожидать, поскольку колонки содержали один и тот же сорбент. Однако на более длиной колонке с более длительным временем прохождения наблюдался небольшой сдвиг времени удерживания. Параметры производительности хроматографического процесса для 15 калибровочных стандартов времени удерживания пептидов, добавленных к образцам в качестве индикаторов качества, представлены на рисунке 2A. По сравнению с колонкой длиной 50 см применение колонки длиной 75 см привело к улучшению ряда характеристик, включая коэффициенты вариации медианных площадей пиков пептидов, значения полной ширины на половине максимума и времени удерживания в условиях обоих градиентов.

Формула 1 для вычисления емкости пика (где n – количество пиков, используемых при вычислениях, TG – длительность градиента, Wp – полная ширина на половине высоты пика), также применялась для оценки аналитической способности каждой конфигурации проведения эксперимента. Проведенный анализ показал улучшение характеристик при более длительных градиентах, а также колонок большей длины (рисунок 2B). Градиент в течение 240 минут в сочетании с колонкой длиной 75 см позволило получить значение емкости пика Cp=827, что почти в два раза превышает результат, полученный Hsieh и др [11].

                                                                             

формула.jpg



Высокая аналитическая пропускная способность является одним из важнейших требований при решении многочисленных задач протеомики в условиях отбора больших объемов проб. Полученные результаты показывают, что колонка длиной 75 см позволяет достичь более высокого значения Cp по сравнению с колонкой 50 см в условиях более длительного времени градиента, что говорит о повышенной эффективности применения колонок большей длины. Кроме того, рабочее противодавление колонки длиной 75 см не достигает максимально допустимого значения системы EASY-nLC 1200, что позволяет дополнительно оптимизировать параметры ЖХ-МС/МС и повысить качество разделения с использованиям данных колонок.


Более глубокое определение протеом

Количество пептидов, идентифицированных при анализе, является важным параметром в протеомных исследованиях и может напрямую влиять на достоверность результатов и выводы. Как показано на рисунке 3, колонка длиной 75 см позволяла идентифицировать наибольшее количество пептидов и белков (с разницей не менее 7 %).

В то время как использование меньших колонок обычно приводит к воспроизводимости около 80%, воспроизводимость идентификации пептидов и белков для трех повторных анализов для приведенного набора данных в рамках данного исследования превышала 95%.

Более яркий источник и пропускание квадруполя прибора Orbitrap Fusion Lumos, сверхвысокая частота сканирования до 20 Гц и способность выполнять параллельное выделение, фрагментацию и сканирование иона-предшественника в двойной линейной ионной ловушке гарантировали эффективную фрагментацию большинства обнаруженных при исследовании ионов, что привело к превосходной идентификации пептидов и белков.

Представленные на рисунке 4А данные, указывают на стабильно высокий уровень идентификации пептидов на протяжении всего градиента ЖХ-МС/МС с применением колонок 75 см. Повышенная производительность объясняется достижением улучшенного разделения на колонках длиной 75 см, которое позволяет пептидам элюироваться при более высоких концентрациях, дает более качественные спектры МС/МС и, в свою очередь, приводит к более точной идентификации. На рисунке 4B приведено ранжирование идентифицированных и количественно определяемых белков для 4-часового градиента, как и ожидалось, более длинная колонка обеспечивает более широкий охват протеом.

Результаты анализа путей дали тот же профиль преобладающих путей для обоих колонок, но с разной степенью охвата, демонстрируя, что общее исследование было беспристрастным. На рисунке 4C показано, что данные, полученные для колонки 75 см с 4-часовым градиентом, обеспечивают прямое количественное определение приблизительно половины белков в каждом из 23 преобладающих путей.


Улучшенное количественное определение

Новый подход позволил получить значительные улучшения в количественной оценке. При использовании колонки длиной 75 см число количественно определяемых пептидов увеличилось на 20%, также удалось достичь более высокой корреляции между опытами (> 85%). Более низкие коэффициенты вариации для этих пептидов и белков также приводили к более точному количественному определению.

Увеличение количества вводимого в колонку белкового лизата в два раза от 1 мкг до 2 мкг не оказало значительного влияния на число измеряемых пептидов либо идентифицируемых белков. При этом увеличение объема вводимой пробы повысило корреляцию между прогонами до 89 %, и привело к двукратному росту количества белков с коэффициентом вариации ниже 5 %. Показанное повышение производительности подчеркивает потенциальную возможность обеспечения более точного количественного определения протеом при повышении объема загрузки колонки.


Заключение

Новейшие системы СВЭЖХ могут работать с высокими противодавлениями, что открывает возможность применения более длинных колонок и в сочетании с современными спектрометрами Orbitrap позволяет получить превосходные уровни идентификации пептидов с максимальной пропускной способностью.

Благодаря исключительной управляемости и глубине анализа описанные технологии представляют собой чрезвычайно мощную платформу для проведения высокоэффективных протеомных исследований с возможностью анализа больших объемов образцов. Увеличение длины колонки с 50 см до 75 см привело к улучшенному разделению и повышению количества обнаруженных уникальных пептидов на 10 %, а также увеличению количества идентифицированных белков на 7%.

Описанная конфигурация эксперимента обеспечила идентификацию около 6500 белков без необходимости фракционирования, при этом была достигнута воспроизводимая количественная оценка более 5000 белков на основе трех повторных вводов проб, что подчеркивает потенциал этого метода как высокоэффективного и надежного альтернативного подхода для количественной протеомики.
Вернуться обратно
ОПУБЛИКОВАТЬ В СОЦ.СЕТЯХ