Выделение галлат эпигаллокатехина и других полифенолов из зеленого чая

20.05.2020
Выделение галлат эпигаллокатехина и других родственных полифенолов из зеленого чая с помощью метода фракционирования по массе.

Аннотация

Галлат эпигаллокатехин является одним из основных метаболитов в зеленом чае, который в ряде исследований показал положительное влияние на здоровье человека. Данную целевую молекулу выделяли совместно с тремя другими полифенольными соединениями с помощью системы препаративной ВЭЖХ AZURA®, используя метод фракционирования по массе. Применяемый метод позволяет свести к минимуму количество фракций, что приводит к значительному сокращению времени анализа, исходя из чего можно сделать вывод о том, что фракционирование по массе является идеальным методом выделения натуральных продуктов. 

Введение

Катехины – полифенольные метаболиты, которые присутствуют в растениях. В последние десятилетия к молекулам из группы флавоноидов проявляется большой интерес из-за их антиоксидантных свойств. В частности, было проведено большое количество исследований галлат эпигаллокатехина на предмет его положительного воздействия на здоровье человека. Данное вещество можно приобрести как диетическую добавку, кроме того, оно в больших присутствует количествах в листьях зеленого чая. В настоящей статье представлен простой и быстрый метод выделения галлат эпигаллокатехина и других связанных катехинов из экстракта зеленого чая, основанный на методе фракционирования по массе.

Структура галлат эпигаллокатехина

Структура галлат эпигаллокатехина

 

Полученные результаты

Метод выделения галлат эпигаллокатехина из экстракта зеленого чая был разработан с применением аналитической системы ВЭЖХ AZURA Analytical HPLC plus и колонки Eurospher II C18 (рис. 1). Затем разработанный метод был перенесен на препаративную систему AZURA с возможностью фракционирования по молекулярной массе (рис. 2). В процессе работы выполнялся сбор фракции с молекулярной массой галлат эпигаллокатехина (m/z 457,4; [M-H]-) (рис. 3). В дополнение к этой фракции, также собирали еще три фракции, соответствующие эпикатехину, галлату эпикатехина и эпигаллокатехину (m/z 289,2; m/z 305,2; m/z 441,4; [M-H]-). Последующий анализ целевой фракции с помощью ВЭЖХ показал возможность выделения галлат эпигаллокатехина с помощью метода фракционирования по массе с чистотой более 95% (рис. 4). Также данный метод позволил выделить три других катехина с чистотой более 90% (рис. А1-А3).

analiz-chaya-ris1.jpg.png  

Рисунок 1 – Аналитическая хроматограмма неочищенного экстракта зеленого чая при длине волны детектирования 220 нм; разделение со ступенчатым градиентом 10 % ацетонитрила до 26 мин, далее 15 % ацетонитрила


analiz-chaya-ris2.jpg.png  

Рисунок 2 – УФ-хроматограмма выделения неочищенного экстракта зеленого чая, длина волны детектирования 220 нм


analiz-chaya-ris3.jpg.png

Рисунок 3 – SIM (мониторинг одиночных ионов) хроматограмма выделения для целевой молекулярной массы m/z 457.4


analiz-chaya-ris4.jpg.png 

Рисунок 4 – Аналитическая хроматограмма третьей фракции, содержащей галлат эпигаллокатехин (m/z 457,4; [М-Н]-); разделение с линейным градиентом 5 % - 50 % ацетонитрила.

 

Материалы и метод

Для разработки метода использовали аналитическую систему ВЭЖХ AZURA Analytical HPLC Plus. В результате оптимизации метода с применением данной аналитической системы выделение полифенолов из зеленого чая выполнялось в условиях ступенчатого градиента. Для выделения галлат эпигаллокатехина по массе использовали препаративную систему ВЭЖХ AZURA. В состав системы входил насос AZURA P 2.1L с насосной головкой на 250 мл и трехканальный тернарный модуль с малым градиентом давления (LPG), ручной клапан впрыска (1/8”, 6 портов, 2 положения) с пробоотборной петлей на 5 мл, детектор AZURA UVD 2.1S, оборудованный проточной ячейкой на 3 мм, масс-спектрометр 4000 MiD с пробоотборником MiDas, коллектор фракций Foxy R1 и колонка Eurospher II 100-5 C18 150 x 20 мм.

Ступенчатый градиент выполняется в течение 50 мин при скорости потока 18,9 мл/мин с применением следующего состава: 0 мин 10% B, 40 мин 10% B, 40,1 15% B, 50 мин 15% B, в качестве элюентов использовали воду с 0,1% муравьиной кислоты (А) и ацетонитрил (В). Рабочая длина волны детектора составляла 220 нм при скорости передачи данных 10 Гц, масс-селективный детектор работал в режиме отрицательного мониторинга одиночных ионов с отслеживанием молекулярных масс m/z 289,2, 305,2, 441,4, 457,4. Экстракт зеленого чая подготавливали посредством ультразвуковой обработки измельченных листьев зеленого чая в течение 60 минут с применением 75 % этанола, последующей фильтрации и разбавления водой в соотношении 1:1. 

Заключение

Галлат эпигаллокатехин является одним из основных метаболитов в зеленом чае. При проведении исследований выделение целевой молекулы совместно с тремя другими полифенольными соединениями выполнялось с помощью системы препаративной ВЭЖХ AZURA методом фракционирования по массе. Благодаря этому методу количество фракций было сведено к минимуму, что привело к значительному сокращению времени анализа. 

 

Дополнительные результаты

analiz-chaya-ris5.jpg.png

Рисунок A1 – Аналитическая хроматограмма первой фракции, содержащей эпигаллокатехин (m/z 305,2; [М-Н]-); разделение с линейным градиентом 5 % - 50 % ацетонитрила.


analiz-chaya-ris6.jpg.png

Рисунок A2 – Аналитическая хроматограмма второй фракции, содержащей эпикатехин (m/z 289,2; [М-Н]-); разделение с линейным градиентом 5 % - 50 % ацетонитрила.


analiz-chaya-ris7.jpg.png

Рисунок A3 – Аналитическая хроматограмма четвертой фракции, содержащей галлат эпикатехина (m/z 441,4; [М-Н]-); разделение с линейным градиентом 5 % - 50 % ацетонитрила.

 

Дополнительные материалы и методы

Таблица A1 – Параметры метода (препаративный)

Элюент A

Вода + 0,1% муравьиная кислота

 

Элюент B

цетонитрил

 

 

Градиент

Время, мин

%A

%B

0

90

10

40

90

10

40.1

85

15

50

85

15

Скорость потока

18.9 мл/мин

Давление в системе

120 бар

Температура колонки

Комнатная температура

Время анализа

50 мин

Объём вводимой пробы

500 мкл

Режим ввода пробы

-

Длина волны детектирования

220 нм

Скорость передачи данных

10 Гц

 

 

Постоянная времени

0.1 с

 

Таблица A2 – Параметры метода (масс-спектрометр)

Режим сканирования

SIM (Мониторинг одиночных ионов)

Скорость сканирования

1 Гц

Шан

0.2

SIM

289.2 m/z, 305.2 m/z, 441.4 m/z, 457.4 m/z

Режим ионизации

Отрицательный

Поток газа

2.5 л/мин

 

Таблица A3 – Конфигурация системы и данные (аналитическая система)

Прибор

Описание

Артикул

Насос

AZURAP6.1L

APH34GA

Автоматический дозатор

AZURA AS 6.1 L

AAA00AA

Детектор

AZURADAD2.1L

ADC01

Проточная ячейка

Проточная ячейка PressureProof 10 мм, 10 мкл

AMC38

Колонка

Eurospher II 100-5 C18 с предколонкой.

Колонка Vertex Plus 150 x 4.6 мм

15VE181E2J

Программное обеспечение

ClarityChrom

Расширение для PDA ClarityChrom 8.1

A1670

A1676

 

Таблица A4 - Конфигурация системы и данные (препаративная система)

Прибор

Описание

Артикул

Насос

AZURA P2.1L

Модуль AZURA LPG для насоса P 2.1L

APE20LA AZZUOAB

Ввод пробы

AZURA V 2.1

A1359

Пробоотборная петля

Пробоотборная петля 5 мл

A0586-2

Детектор

AZURA UVD2.1S

ADA00

Проточная ячейка

Полупрепаративная УФ проточная ячейка 3 мм, 2 мкл

A4042

Масс-спектрометр

4000 MiD с MiDas

A66900

Фракционирование

Отборник фракций Foxy R1

A59100

Колонка

Колонка Eurospher II 100-5 C18, 150x20 мм

15JE181E2J

Программное обеспечение

PurityChrom 5.9.69

PurityChrom обновление до полной версии

Лицензия PurityChrom MS

A2650

A2652

A2655

 



Вернуться обратно
ОПУБЛИКОВАТЬ В СОЦ.СЕТЯХ